গ্রামের দাগ মাইক্রোবায়োলজিতে ব্যাপকভাবে ব্যবহৃত হয় কারণ এটি তাদের কোষ প্রাচীরের গঠনের উপর ভিত্তি করে ব্যাকটেরিয়াকে আলাদা করার সবচেয়ে সহজ উপায়গুলির মধ্যে একটি। গ্রাম অনুসারে, সমস্ত ব্যাকটেরিয়াকে গ্রাম-পজিটিভ (গ্রাম (+)) এবং গ্রাম-নেতিবাচক (গ্রাম (-)) ভাগে ভাগ করা যায়। গ্রাম দাগ পদ্ধতিটি 1884 সালে বিকশিত হয়েছিল এবং তারপর থেকে জনপ্রিয়তা হারায়নি, যদিও এটি বেশ কয়েকবার সংশোধন করা হয়েছে।
কোষ প্রাচীর গঠন
গ্রাম স্টেনিং প্রকাশ করে যে একটি ব্যাকটেরিয়া গ্রাম-পজিটিভ নাকি গ্রাম-নেগেটিভ। গ্রাম (+) এবং গ্রাম (-) এ ব্যাকটেরিয়া বিভাজন তাদের কোষ প্রাচীরের গঠন অনুসারে পরিচালিত হয়।
কোষ প্রাচীরে সর্বাধিক পরিমাণে পেপ্টিডোগ্লাইকান (মিউরিন) থাকে - একটি জটিল পদার্থ, যার মধ্যে রয়েছে পেপটাপেপটাইড এবং গ্লাইকান। গ্লাইক্যানে β-1 দ্বারা একে অপরের সাথে যুক্ত N-acetylglucosamine এবং N-acetylmuramic অ্যাসিডের পর্যায়ক্রমে অবশিষ্টাংশ রয়েছে।4-গ্লাইকোসিডিক বন্ধন। পেপটিডোগ্লাইকান কোষের আকৃতি রক্ষণাবেক্ষণ, অসমোটিক সুরক্ষা এবং অ্যান্টিজেনিক ফাংশন প্রদান করে।
গ্রাম-পজিটিভ এবং গ্রাম-নেগেটিভ ব্যাকটেরিয়ার মধ্যে প্রধান পার্থক্য
বিভিন্ন ব্যাকটেরিয়ার বিভিন্ন পেপ্টিডোগ্লাইকান স্তরের পুরুত্ব থাকে। গ্রাম-পজিটিভ হিসাবে শ্রেণীবদ্ধ করা ব্যাকটেরিয়াগুলিতে, এটি 15 থেকে 80 এনএম পর্যন্ত হয়, যখন গ্রাম-নেতিবাচক ক্ষেত্রে এটি 2 থেকে 8 এনএম পর্যন্ত হয়। একই সময়ে, গ্রাম-নেতিবাচক ব্যাকটেরিয়া পেপটিডোগ্লাইকান স্তরের অধীনে একটি বিশেষ গঠন রয়েছে, যা গ্রাম-পজিটিভ ব্যাকটেরিয়া নেই - পেরিপ্লাজমিক স্থান। এই স্থানটি হাইড্রোলাইটিক এনজাইম দিয়ে পূর্ণ - β-ল্যাকটামেজ, রিবোনুক্লিজ 1, ফসফেটেস। এই এনজাইমগুলিই অনেক অ্যান্টিবায়োটিকের বিরুদ্ধে গ্রাম-নেগেটিভ ব্যাকটেরিয়ার প্রতিরোধের জন্য দায়ী৷
ব্যাকটেরিয়ার গ্রাম(-) পেপ্টিডোগ্লাইকান স্তর লিপোপলিস্যাকারাইডের সাথে আবদ্ধ, এন্ডোটক্সিন ধারণকারী একটি অ্যান্টিজেনিক গঠন। গ্রাম(+) ব্যাকটেরিয়ায়, টাইকোইক অ্যাসিড একই রকম কাজ করে।
গ্রাম-নেগেটিভ ব্যাকটেরিয়া একটি অতিরিক্ত গঠন আছে - বাইরের ঝিল্লি।
দাগ দেওয়ার পদ্ধতির সারাংশ
আপনি দাগ দেওয়া শুরু করার আগে, অধ্যয়ন করা ব্যাকটেরিয়াগুলির দাগ প্রস্তুত করা হয়। এটি করার জন্য, একটি গ্লাস স্লাইডে জল ফোটানো হয় এবং সেখানে একটি ব্যাকটেরিয়া লুপ দিয়ে অণুজীবের সংস্কৃতি যোগ করা হয়। তারপর, জল সম্পূর্ণরূপে শুকিয়ে যাওয়ার পরে, স্মিয়ারটি স্থির করা হয় - কাচের স্লাইডটি বার্নার শিখার উপরে বেশ কয়েকবার বাহিত হয়। লাইভ ব্যাকটেরিয়া দাগের চেয়ে গ্রাম স্টেনিং বেশি কার্যকর - রঞ্জক অণুগুলি মৃত কোষের সাথে আরও ভালভাবে আবদ্ধ হয়৷
রঙ করা হয় বিভিন্ন পর্যায়ে:
- ফিল্টার পেপারের ছোট টুকরোগুলি একটি নির্দিষ্ট দাগের উপর স্থাপন করা হয় এবং প্রধান রঞ্জক ঢেলে দেওয়া হয় - জেন্টিয়ান ভায়োলেট বা মিথিলিন নীল।
- 3-5 মিনিটের পরে, রঙিন ফিল্টার পেপারটি সরান এবং 1 মিনিটের জন্য লুগলের দ্রবণ দিয়ে স্মিয়ারটি পূরণ করুন। এই ক্ষেত্রে, প্রস্তুতি অন্ধকার হয়ে যায়।
- লুগলের দ্রবণটি নিষ্কাশন করা হয় এবং স্মিয়ারটি বিশুদ্ধ ইথাইল অ্যালকোহল দিয়ে চিকিত্সা করা হয়: কয়েক ফোঁটা প্রস্তুতির উপর ড্রপ করা হয়, 20 সেকেন্ড পরে নিষ্কাশন করা হয়। পদ্ধতিটি 2-3 বার পুনরাবৃত্তি হয়৷
- পরীক্ষার স্লাইডটি পাতিত জল দিয়ে ধুয়ে ফেলুন৷
- অতিরিক্ত দাগ তৈরি করুন - ফুচসিন দিয়ে প্রস্তুতি শেষ করুন। 1-2 মিনিট পরে, ছোপ ধুয়ে ফেলা হয়।
- জল শুকিয়ে যাওয়ার পরে, একটি মাইক্রোস্কোপের নীচে দাগটি পরীক্ষা করুন। গ্রাম-পজিটিভ ব্যাকটেরিয়া হবে নীল-বেগুনি, গ্রাম-নেগেটিভ ব্যাকটেরিয়া হবে গোলাপী বা লাল।
বিভিন্ন স্টেনিং প্যাটার্নের কারণ
উপরে বর্ণিত হিসাবে, ব্যাকটেরিয়ার গ্রাম-দাগ গ্রাম-পজিটিভ ব্যাকটেরিয়া ব্লু-ভায়োলেট, অন্যদিকে গ্রাম-নেতিবাচক ব্যাকটেরিয়া লাল বা গোলাপী দাগ দেয়। এই পদ্ধতিতে ব্যাকটেরিয়ার ডিফারেনশিয়াল স্টেনিংয়ের কারণ হল জেন্টিয়ান ভায়োলেটের দ্রবণীয় রূপ কোষে প্রবেশ করার পরে, রঞ্জক অদ্রবণীয় আয়োডিন আকারে চলে যায়। ইথাইল অ্যালকোহল দিয়ে ব্যাকটেরিয়ার চিকিত্সার সময়, এই অ-মেরু দ্রাবকের ক্রিয়ায় ঝিল্লি থেকে লিপিডগুলি বের করা হয়। ঝিল্লি তখন ছিদ্রযুক্ত হয়ে যায় এবং ডাই লিচিং এর জন্য আর কোন উল্লেখযোগ্য বাধা থাকে না। যাহোকপেপটিডোগ্লাইকান অ্যালকোহল সহ অ-পোলার দ্রাবকগুলির জন্য আরও প্রতিরোধী। তিনিই রঞ্জক পদার্থ থেকে ধোয়া প্রতিরোধ করেন, তাই পুরু মিউরিনের স্তরযুক্ত ব্যাকটেরিয়া নীল-বেগুনি (গ্রাম-পজিটিভ) হয়ে যায় এবং অ্যালকোহল দিয়ে চিকিত্সা করার পরে তারা তাদের রঙ পরিবর্তন করে না।
গ্রাম-নেগেটিভ ব্যাকটেরিয়ার পাতলা মিউরিন স্তর কোষে রঞ্জক অণু ধরে রাখতে পারে না, তাই অ্যালকোহলের ক্রিয়া করার পরে তারা বর্ণহীন হয়ে যায় - গ্রাম-নেগেটিভ দাগ।
ফুচসিনের দাগের সংস্পর্শে আসার পরে, গ্রাম-দাগযুক্ত ব্যাকটেরিয়া নীল-বেগুনি থেকে যায়, আর গ্রাম-নেগেটিভ ব্যাকটেরিয়া গোলাপী-লাল হয়ে যায়।
গ্রাম(+) এবং গ্রাম(-) ব্যাকটেরিয়ার উদাহরণ
গ্রাম-নেতিবাচক ব্যাকটেরিয়ার মধ্যে রয়েছে সায়ানোব্যাকটেরিয়া, সালফার ব্যাকটেরিয়া, আয়রন ব্যাকটেরিয়া, ক্ল্যামাইডিয়া, রিকেটসিয়া, অ্যাসিটিক ব্যাকটেরিয়া, অনেক মেথিলোব্যাকটেরিয়া, থায়োনিক ব্যাকটেরিয়া, আর্সেনিটোব্যাকটেরিয়া, কার্বক্সিব্যাকটেরিয়া।
Bifidobacteria, অনেক জলজ ব্যাকটেরিয়া, streptococci এবং staphylococci হল গ্রাম-পজিটিভ।
